Nhóm của TS. Nguyễn Trí Nhân (Khoa Sinh học - Công nghệ Sinhhọc, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM) và công ty Pharmedicđã nghiên cứu bào chế thành công loại gel chứa nhân tố tăng trưởng có nguồn gốctừ tiểu cầu người dạng BB tái tổ hợp, có tiềm năng làm liền hiệu quả các vếtthương dai dẳng và khó lành ở người bệnh.

Giải pháp tiềm năng cho vết thương mãn tính

Một trong những nỗi lo lắng lớn nhất đối với nhiều bệnh nhân mắcđái tháo đường là nguy cơ một ngày nào đó, họ sẽ có thể phải cắt cụt chi vì bịnhiễm trùng từ những vết loét trên cơ thể. Với tỉ lệ khoảng 15% người mắc đáitháo đường gặp phải các vết loét khó lành, TS. Nguyễn Trí Nhân cho biết, vấn đềnày càng đáng quan tâm khi Việt Nam có 3,8 triệu người đang bị đái tháo đườngvà dự kiến có thể đạt 6,3 triệu người vào năm 2045, theo thống kê của Hiệp hộiĐái tháo đường Thế giới vào năm 2019.

Nhưng không chỉ xảy ra với người bị tiểu đường, các vết thươngmãn tính như vậy còn bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân khác như vết loét do tì đè,loét tĩnh mạch, xạ trị,... Theo thống kê của Khoa Liền vết thương – Viện BỏngQuốc gia vào năm 2014 trên 430 bệnh nhân được theo dõi, số bệnh nhân mang vếtthương mạn tính chiếm tỷ lệ cao hơn gấp bảy lần so với số bệnh nhân mang vếtthương cấp tính (87,67% so với 12,33%). Và nếu những vết thương này không đượcchăm sóc hiệu quả, người bệnh sẽ có thể gặp nhiều di chứng nặng nề và ảnh hưởngnghiêm trọng đến cuộc sống.

Thực tế, để điều trị các vết thương mãn tính, các nhà khoa họctrên thế giới đã nghiên cứu và cho ra đời Becaplermin hay protein rhPDGF-BB(nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu người dạng BB tái tổ hợp) - sản phẩmđầu tiên được tổ chức FDA (Mỹ) cấp phép với tên gọi Regranex để điều trị loétchi ở bệnh nhân đái tháo đường. “Đây là protein có vai trò quan trọng trong quátrình làm lành vết thương, kích thích sự phát triển của phôi thai và hình thànhmạch máu”, TS. Nhân cho biết trong buổi hội thảo online mới đây của nhóm cácnhà khoa học Innovative BioScience Group.

Ở những bệnh nhân đái tháo đường, hoạt động phân giải proteinkéo dài đã ảnh hưởng đến chất nền ngoại bào (ECM) và làm thiếu hụt một số nhântố tăng trưởng như PDGF để tự làm lành vết thương. Do đó, loại thuốc bôi sửdụng protein này có tác dụng bổ sung cho hoạt động sản sinh PDGF ở vết thươngcủa người bệnh, từ đó kích thích tăng sinh nguyên bào sợi và làm liền các vếtloét. Đây cũng là sản phẩm đã được thử nghiệm và điều trị thành côngtrên một sốlượng nhỏ bệnh nhân mang các vết thương mạn tính khác như vết loét do tì đè, xạtrị, phẫu thuật, loét tĩnh mạch, loét động mạch.

Tuy nhiên, hiện nay giá thành của loại thuốc này rất đắt. “Mộttuýp thuốc Regranex khi nhập về Việt Nam có những thời điểm có giá khoảng 13triệu đồng, và để điều trị một vết loét 2cm2 thì cần phải dùng khoảng 2,5tuýp, tương đương với 32 triệu đồng. Do đó vẫn còn nhiều bệnh nhân phải chấpnhận sống chung với vết thương, hoặc thậm chí dẫn đến đoạn chi hay gây tửvong”, TS. Nhân cho biết. Trước bài toán này, năm 2013, nhóm nghiên cứu củaPGS.TS Đặng Thị Phương Thảo, TS. Nguyễn Trí Nhân và các đồng nghiệp quyết địnhbắt tay vào thực hiện việc nghiên cứu sản xuất rhPDGF-BB tái tổ hợp trong nướcvà thuốc dựa trên nguyên liệu này nhằm tạo ra sản phẩm điều trị vết thương mạntính với giá thành thấp hơn sản phẩm gốc (lúc này bằng sáng chế của sản phẩmgốc đã hết thời gian bảo hộ).

Những tưởng việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc tươngtự sinh học (biosimilar - thuốc có cấu trúc và chức năng giống với thuốc gốc)sẽ không quá phức tạp, song thực tế, nếu không kiên trì theo đuổi đề tài nghiêncứu suốt hơn bảy năm, nhóm của TS. Nguyễn Trí Nhân sẽ khó có thể xây dựng thànhcông các quy trình lên men, tinh chế, bảo quản và nhân rộng quy mô sản xuất đểvừa đảm bảo được các chỉ tiêu về hàm lượng protein, hoạt lực sinh học cũng như cácchỉ tiêu quan trọng khác để sản xuất thuốc, lại vừa giảm được giá thành sảnphẩm. Vậy quá trình này có gì khó khăn?

Từng bước nội địa hóa sản phẩm

Một trong những thách thức đầu tiên xuất hiện khi nhóm củaPGS.TS Thảo quyết định lựa chọn nấm men Pichia pastoris để làm hệthống biểu hiện protein thay vì sử dụng nấm men Saccharomycescerevisiae như thuốc gốc. “Pichia pastoris là loại nấm men có khảnăng tiết protein mục tiêu với số lượng lớn, ít tạp, do đó mình sẽ có thể làmgiảm độ phức tạp của quá trình tinh sạch, từ đó giảm chi phí sản xuất”, TS.Nhân lý giải. Tuy nhiên, điểm khó nằm ở chỗ, chủng nấm men này chưa được thửnghiệm nhiều trong sản xuất protein tái tổ hợp ở quy mô pilot như cácchủng E. coli hay S. cerevisae, do đó nhiều đơn vị họcthuật lẫn doanh nghiệp ở Việt Nam đều có ít kinh nghiệm để xây dựng quy trìnhcông nghệ.

Muốn có chủng nấm men có khả năng biểu hiện mạnh như mong muốn,nhóm nghiên cứu sẽ không thể dùng ngay nấm men có sẵn mà phải mất công để tạora chủng này - một công đoạn không dễ dàng. Thêm vào đó, Pichia pastoris cónhược điểm là tiết ra rất nhiều enzyme protease - loại enzyme có thể gây phânhủy protein cần sản xuất. Sau khi nghiên cứu nhiều tài liệu, PGS.TS Thảo, TS.Nhân và các đồng nghiệp đã lựa chọn hướng đi tạo dòng nấm men tái tổ hợp mangđa bản sao gene biểu hiện protein để có thể tăng khả năng biển hiện protein mụctiêu, đồng thời, họ phải khảo sát rất kỹ các điều kiện pH thấp, nồng độ chấtcảm ứng, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy để đảm bảo khả năng sinh trưởng của nấmmen.

Từ dòng nấm men do PGS.TS Thảo và cộng sự cung cấp, nhóm TS.Nhân đã đưa ra được một quy trình lên men cơ bản và tối ưu các điều kiện quantrọng ở quy mô 0,5 lít. Kết quả ban đầu ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy,phương pháp này giúp tạo ra được hơn 600 mg protein/L, cao gấp nhiều lần so vớimức 32 mg/L nếu sử dụng loại nấm men trong thuốc gốc. Thế nhưng những cái khónhất thường chỉ bắt đầu lộ diện khi một quy trình sản xuất được gia tăng quymô. TS. Nhân nhớ lại, để làm ra được 1000 tuýp gel, nhóm nghiên cứu sẽ cần tạora được 1,5 g protein, tương đương với 4,5-6 g protein trước khi tinh sạch.“Song khi thử nâng quy mô sản xuất lên 7,5 lít, năng suất sản xuất protein lạigiảm mạnh, và khi chúng tôi thử sản xuất ở mức 25 lít thì thậm chí lượng proteintạo ra được còn thấp hơn nhiều so với quy mô trước đó”, TS. Nhân nhớ lại mộtthất bại mà nhóm đã gặp phải.

Nút thắt chỉ được gỡ khi nhóm của anh phát hiện ra, việc bổ sungmethanol - chất để cảm ứng nấm men - cần phụ thuộc vào sự thay đổi nồng độ oxyhòa tan ở trong dịch lên men để tránh tích lũy methanol dư thừa và gây ức chếsự tăng trưởng của protein. “Do không có đầu dò để kiểm tra được nồng độmethanol, chúng tôi quyết định chọn giải pháp là ‘xung methanol’ (chỉ khi nàomethanol cạn kiệt thì mới bổ sung thêm) dựa vào việc kiểm tra sự tăng giảm củanồng độ oxy hòa tan”, TS. Nhân cho biết.

Cuộc thi “vượt chướng ngại vật” đến đây vẫn chưa phải để kếtthúc. Khi tiến hành tinh sạch protein thu được, họ lại phải trải qua một nỗithất vọng mới bởi hiệu suất thu hồi protein chỉ đạt 13%. “Hóa ra, phương pháplọc tiếp tuyến - phương pháp hiện đang được dùng hiệu quả trong nhiều khâu củacông nghiệp sản xuất sinh dược phẩm hiện nay - lại không hoàn toàn phù hợp vớibài toán như thế này”, TS. Nhân rút ra bài học, “sau khi khảo sát nhiều lần vàbỏ công đoạn này đi, thay bằng một phương pháp pha loãng và điều chỉnh pH đơngiản, kết hợp với quy trình tinh chế 'một bước duy nhất' của sắc ký trao đổication, hiệu suất thu hồi của chúng tôi đã đạt được 35%”.

Nhờ kiên trì giải từng nút thắt, nhóm của TS. Nhân đã xây dựngthành công quy trình lên men mẻ bổ sung ở thể tích 25 lít và thu được trungbình hơn 9g protein rhPDGF-BB trong mỗi mẻ lên men. Đồng thời, nhóm cũng hoànthiện được quy trình tinh chế rhPDGF-BB bằng sắc ký trao đổi cation trên cột tựnhồi 400ml, sử dụng phương pháp dung ly gradient và phương pháp dung lystepwise. Kết quả đạt được vượt ngoài mong đợi của họ khi phương pháp này giúpthu trung bình hơn 3g protein với độ tinh sạch ≥95% trên mỗi mẻ tinh chế.

Nhóm của TS. Nhân cũng đãhợp tác với Công ty CP Dược Phẩm DượcLiệu Pharmedic xây dựng bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu dựa trên Dượcđiển Việt Nam V và Dược điển Mỹ USP40, cũng như bào chế gel becaplermin(rhPDGF-BB) 0,01%, dạng tuýp 15g, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Thêm vào đó, thử nghiệmcũng cho thấy hoạt lực sinh học của sản phẩm cao hơn protein trong mẫu gel cóchức năng tương tự của Ấn Độ. Ngoài ra, “chế phẩm gel rhPDGF-BB0,01% đã đượckiểm tra tính an toàn, cho thấy không gây kích ứng da và có khả năng làm lànhnhanh vết thương hiệu quả trên mô hình chuột đái tháo đường”, TS. Nhân hào hứngchia sẻ.

“Dù PDGF được biết là có thể gây một phản ứng phụ kích thíchtăng sinh của tế bào một cách bất thường, tuy nhiên đến nay sản phẩm gốcRegranex vẫn đang được FDA cho lưu hành, cho thấy tỉ lệ người gặp phải nguy cơnày khá thấp và không quá nguy hiểm”, TS. Nhân lưu ý thêm về một số lo ngạiliên quan đến khả năng gây tăng sinh tế bào ung thư của loại protein này.

Nếu được thương mại hóa thành công, sản phẩm gel của nhóm TS.Nhân dự kiến sẽ có mức giá khoảng 1-2 triệu đồng, giúp cho nhiều bệnh nhân vớimức thu nhập trung bình có thể được tiếp cận điều trị. Song, để có thể ra đượcthị trường như vậy, “sản phẩm sẽ cần phải trải qua tất cả các thử nghiệm lâmsàng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả điều trị trên người, cũng như nângquy mô sản xuất ở mức công nghiệp” - một công đoạn ẩn chứa nhiều rủi ro thấtbại và đòi hỏi phải được đầu tư bài bản, TS.Nhân chia sẻ.