1. Đặt vấn đề
Tiêu chảy ở lợn con do vi khuẩn E. coli nhóm ETEC đã và đang là nguyênnhân quan trọng gây tổn thất kinh tế lớn đối với ngành chăn nuôi lợn. Các yếu tốgây bệnh của chúng đã được xác định đó là các kháng nguyên bám dính như F4, F5,F18… Nhiều nghiên cứu sản xuất vắc-xin sử dụng kháng nguyên là các yếu tố bámdính của vi khuẩn để sản xuất vắc-xin. Tuy nhiên, hiệu lực của vắc-xin vẫn cònrất thấp do sự đa dạng về kháng nguyên bám dính của nhóm vi khuẩn ETEC cũng nhưmột số chủng vi khuẩn ETEC mặc dù không mang kháng nguyên bám dính nhưng vẫn cókhả năng gây tiêu chảy ở lợn con.
Theo Zhang và Sack (2012), phát triển vắc-xinsử dụng đồng thời cả 3 loại độc tố đường ruột STa, STb và LT là một hướng đi cóthể mang lại hiệu quả phòng bệnh cao. Chính vì vậy, chúng tôi đặt vấn đề nghiêncứu sản xuất vắc-xin từ độc tố đường ruột tái tổ hợp để phòng tiêu chảy do ETECsinh ra ở lợn. Mục tiêu chính của đề tài là ứng dụng công nghệ gen sản xuấtthành công vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh do E.coli sinh độc tố đường ruột (ETEC) gây ra trên lợn.
2. Vật liệu, phươngpháp và thời gian nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiêncứu
-Chủng vi khuẩn: 59 chủng ETEC phân lập từ lợn con tiêuchảy tại các vùng địa lý khác nhau và được lưu giữ tại Phân viện thú y miềnTrung.
-Môi trường, hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn ETEC: LB broth (Luria-Bertanibroth), LB agar, BHI (Brain Heart Infusion), 2xYT (2x yeast extract tryptone),TRB (Terrific Broth).
-Các hóa chất, sinh phẩm dùng cho chiết tách DNA, phản ứng PCR, chuyển gen và giảitrình tự gen: mồi các loại (IDT), GoTaq green master mix (Promega), DNA marker(Promega), QIAGEN PCR cloningplus Kit (231224, Qiagen), QIAquick Gel extractionkit (28704, Qiagen), QIAquick PCR purification kit (28104, Qiagen), QIAGENPlasmid Mini Kit (12125, Qiagen), BCA Protein Assay Kit (23227, ThermoFisher),protein marker (26616, ThermoFisher).
2.1. Phương phápnghiên cứu
-Đánh giá tương đồng gen mã hóa độc tố đường ruột STa, STb và LT của vi khuẩn E. Coli.
-Phát triển DNA tái tổ hợp mã hóa STa, STb và LT.
-Phát triển vector biểu hiện protein độc tố đường ruột tái tổ hợp STa - LTB -STb (protein SLS).
-Tiêu chuẩn hóa quy trình nuôi cấy và tinh chế protein SLS.
-Sản xuất thử nghiệm vắc-xin protein độc tố đường ruột tái tổ hợp SLS.
-Kiểm nghiệm vắc-xin.
-Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.0 và Excel 2010. Sự sai khác giữa các giá trịcó ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05.
2.3. Thời gian nghiêncứu:01/01/2016 – 31/12/2018.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Nghiên cứu tiêuchuẩn hóa quy trình nuôi cấy và tinh chế protein độc tố đường ruột tái tổ hợpSTa-LTB-STb
3.1.1. Tiêu chuẩn hóaquy trình nuôi cấy chủng vi khuẩn biểu hiện protein SLS
Kết quả phân tích tho thấy, để thu đượcprotein SLS với nồng độ cao nhất, chủng SLS321 được nuôi cấy trong môi trường2xYT ở 30oC, lắc 150 vòng/phút, bổ sung IPTG khi mật độ tế bào trongmôi trường (giá trị OD600) đạt 0,6; nồng độ IPTG cuối cùng là 1mM và thu hoạchvi khuẩn khoảng 12 giờ sau khi tiếp giống (vi khuẩn bắt đầu phát triển đến phacân bằng).
3.1.2. Quy trình tinhsạch protein SLS
Chủng SLS321 được nuôi cấy trong môi trường2xYT ở 30oC, lắc 150 vòng/phút, bổ sung IPTG khi mật độ tế bào trongmôi trường (giá trị OD600) đạt 0,6; nồng độ IPTG cuối cùng là 1mM và thu hoạchvi khuẩn khoảng 12 giờ sau khi tiếp giống (vi khuẩn bắt đầu phát triển đến phacân bằng). Hoàn nguyên xác vi khuẩn trong lysis buffer và tiến hành phá vở tếbào bằng máy phá tế bào. Protein SLS được tinh chế bằng hê thống sắc ký AKTA25M, sử dụng cột HisTrap HP, nồng độ imidazole trong elution buffer là0,5M.Protein SLS sau tinh chế được kiểm tra bằng SDS – PAGE và xác định nồng bộbằng phương pháp BCA.
3.2. Sản xuất thử nghiệm vắc-xin tái tổ hợp độc tố đườngruột (vắc-xin Coli RE I.Vac)
3.2.1. Kết quả kiểm tra tính độc của protein SLS
Kết quả kiểm tra cho thấy tỷ lệ G/C của chuộtuống protein SLS là 0,08 (G/C < 0,09). Điều này chứng tỏ protein SLS khônggây tích nước vào lòng ruột (không gây độc). Trong khi đó, độc tố được tách chiếttừ dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn EcoPV-173 lại cho tỷ lệ G/C > 0,09. Nhưvậy, protein SLS không thể hiện độc tính trên chuột sơ sinh.
3.2.2.Kết quả kiểm tra tính an toàn của protein SLS trên động vật
Tất cả chuột và lợn đều không thể hiện bất cứphản ứng cục bộ tại vị trí tiêm (sưng, nóng, loét,...) cũng như toàn thân. Lợnvà chuột ăn uống và phá ttriển bình thường. Điều này chứng tỏ protein SLS là antoàn với lợn và chuột, có thể sử dụng làm kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịchđặc hiệu.
3.2.3. Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein SLS
Kết quả phân tích cho thấy protein SLS tinhchế có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, liều miễn dịch trên chuột nhắt trắnglà 40 µg/con, trên lợn là 400 µg/con; có thể sử dụng kháng nguyên này kết hợp vớichất bổ trợ là nhôm hydroxyt (20%) để tiêm dưới da hoặc tiêm bắp thịt; ngưỡnghiệu giá kháng thể bảo hộ 100% là 6 log2 (phương pháp ELISA). Đây là cơ sở đểchúng tôi sản xuất vắc protein độc tố đường ruột tái tổ hợp.
3.2.4. Sản xuất thử nghiệm vắc-xin protein độc tố đườngruột tái tổ hợp
Đã sản xuất thử nghiệm được 03 lô vắc-xin ColiRE I.Vac từ kháng nguyên là protein SLS tinh chế với chất bổ trợ là nhômhydroxyt (20% v/v). Số lượng mỗi lô vắc-xin là 4.000 ml với đậm độ kháng nguyênlà 400 µg/ml vắc-xin. Vắc-xin được đóng chai (10 ml/chai) và bảo quản ở 2 – 8oCđể nghiên cứu các chỉ tiêu khác của vắc-xin.
Liều tiêm vắc-xin trên chuột là 0,1 ml/con/dướida, nhắc lại sau 14 ngày hoặc 0,2 ml/con/dưới da (không nhắc lại). Liều tiêm vắc-xintrên lợn là 1 ml/con/dưới da, có thể tiêm nhắc lại sau 14 ngày với liều tiêmtương tự để đạt hiệu quả bảo hộ 100%.
3.2.5. Quy trình sản xuất vắc-xin protein độc tố đường ruộttái tổ hợp
Chủng vi khuẩn SLS321 từ ống đông khô đượchoàn nguyên trong nước muối sinh lý 0,85%, sau đó ria đều lên đĩa môi trường LBagar/ampicillin và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, chọn 1-2 khuẩn lạc đặctrưng (trắng, tròn, bóng) cấy lên môi trường LB broth/ ampicillin và nuôi cấy ở37oC trong vòng 6-8 giờ, lắc liên tục 150 vòng/phút. Sau đó, cấychuyển vào môi trường sản xuất 2xYT, nuôi cấy ở 30oC, lắc 150vòng/phút. Sau khi giá trị OD của canh khuẩn bằng 0,6 (khoảng 4 giờ sau tiếp giống)thì tiến hành bổ sung IPTG sao cho nồng độ cuối cùng là 1mM và nuôi cấy ở 30oCcho đến khi vi khuẩn phát triển đến pha cân bằng (khoảng 12 giờ sau tiếp giống).Sau đó, tiến hành thu hoạch xác vi khuẩn bằng cách li tâm canh khuẩn ở 4.000vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4oC.
Xác vi khuẩn được hoàn nguyên trong lysisbuffer/ lysozyme và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ. Sau đó, tiến hành pháhoàn toàn bằng máy phá vỡ tế bào sonicator trong 10 phút ở tốc độ25.000 vòng/phút. Dịch nổi có chứa protein được thu hoạch bằng cách li tâm12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC.
Tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng hệthống sắc ký AKTA pure 25M với cột sắc ký Histrap HP theo hướng dẫn của nhà sảnxuất. Nồng độ imidazole trong elution buffer là 0,5M.Protein SLS sau tinh chếđược kiểm tra vô trùng, xác định nồng độ bằng phương pháp BCA.
Tiến hành pha loãng protein SLS trong PBS, bổsung nhôm hydroxyt (20% v/v) sao cho nồng độ kháng nguyên cuối cùng đạt 0,4mg/ml vắc-xin, ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ, lắc nhẹ. Phân liều và rachai (10 ml), đóng nút, nắp và bảo quản 2 – 8oC.
3.3. Kết quả kiểmnghiệm vắc-xin protein độc tố đường ruột tái tổ hợp
3.3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng
Vắc-xin được kiểm tra vô trùng dựa theo TCVN8684:2011 trên các loại môi trường như Fluid – thioglycollate hoặc nước thịtgan yếm khí, BHI, thạch máu, thạch nấm (Sabouraud). Kết quả kiểm tra cho thấy cả3 lô vắc-xin đạt chỉ tiêu vô trùng.
3.3.2. Kết quả kiểm tra an toàn
Chỉ tiêu an toàn của vắc-xin được kiểm tratrên chuột nhắt trắng và lợn. Kết quả cho thấy cả 3 lô vắc-xin đều không gây bấtcứ phản ứng nào trên chuột nhắt trắng và lợn. Điều này chứng tỏ vắc-xin đạt chỉtiêu an toàn trên động vật.
3.3.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực
Kết quả cho thấy hiệu giá kháng thể khángprotein SLS ở chuột miễn dịch là từ 6 -7 log2, không phát hiện kháng thể khángprotein SLS trong huyết thanh chuột đối chứng.Hơn nữa, kết quả công cường độccho thấy tỷ lệ bảo hộ chuột ở cả 3 lô vắc-xin là 100%.Hiệu giá kháng thể khángprotein SLS ở lợn miễn dịch là từ 6 -7 log2, không phát hiện kháng thể khángprotein SLS trong huyết thanh lợn đối chứng.Kết quả công cường độc cho thấy tấtcả lợn miễn dịch đều không thể hiện triệu chứng tiêu chảy, lợn đối chứng tiêuchảy 3/3 con/lô vắc-xin.Như vậy, cả 3 lô vắc-xin đạt chỉ tiêu hiệu lực trên độngvật và được bảo hộ tốt với thử thách cường độc.
3.3.4. Kết quả theo dõi độ dài miễn dịch của lợn sau khitiêm vắc-xin
Kết quả cho thấy lợn đã có đáp ứng miễn dịch ởngày thứ 28 sau khi tiêm vắc-xin Coli RE I.Vac đều duy trì kháng thể trong máucho đến tháng thứ 4. Tỷ lệ lợn cho kết quả ELISA dương tính bắt đầu giảm khôngđáng kể từ tháng thứ 5.Đến tháng thứ 7, tỷ lệ mẫu huyết thanh lợn dương tính vớikháng thể kháng protein SLS còn 70%.Như vậy, thời gian bảo hộ lợn sau khi tiêmmiễn dịch được tối thiểu là 6 tháng.
3.3.5. Kết quả theo dõi độ ổn định của vắc-xin trong điềukiện bảo quản
Cho đến thời điểm hiện tại, độ ổn định của vắc-xinColi RE I.Vac trong điều kiện bảo quản 2 – 8oC đang được theo dõi đếntháng thứ 12. Kết quả cho thấy vắc-xin luôn ổn định về cảm quan, vô trùng, antoàn và hiệu lực. Chúng tôi tiếp tục theo dõi thí nghiệm này để đề xuất thời hạnsử dụng của vắc-xin Coli Re I.Vac tối ưu nhất trong điều kiện bảo quản ở nhiệtđộ 2 – 80C, không để đông đá, tránh ánh sáng trực tiếp.
3.3.6. Quy trình kiểm nghiệm vắc-xin Coli Re I.Vac
Quy trình kiểm nghiệm vắc-xin Coli RE I.Vac bổtrợ nhôm hydroxyt được xây dựng dựa trên kết quả nghiên cứu về đường sử dụng;liều sử dụng; tính an toàn, hiệu lực vắc-xin trên lợn và chuột; tham khảo quytrình kiểm nghiệm vắc-xin E. coli lợn (TCVN 8685-3:2011), QCVN 01 - 03:2009/BNNPTNT, TCVN 8684:2011 và Tiêu chuẩn Asean về vắc-xin E. coli.
Kiểmtra cảm quan bằng mắt thường: vắc xin phải đồng nhất, màng trắng ngà,không đông vón cục, không lắng cặn sau khi lắc đều.
Kiểmtra vô trùng
Vắc-xin được kiểm tra vô trùng dựa theo TCVN8684:2011 “Vắc-xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuầnkhiết”.
Cấy vắc-xin trên 2 bộ môi trường: Fluid – thioglycolatehoặc nước thịt gan yếm khí, BHI, thạch máu, thạch nấm (Sabouraud). Lượng vắc-xincấy từ 1 - 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra.Ủ môi trường đã cấy vắc-xintrong tủ ấm ở 37oC, môi trường thạch nấm để ở nhiệt độ phòng.Theodõi môi trường đến 14 ngày. Vắc-xin đạt yêu cầu về vô trùng khi không có bất cứvi sinh vật nào phát triển trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
Kiểm tra an toàn:theo một trong haiphương pháp sau:
1) Kiểm tra an toàn trên lợn: Tiêm bắp hoặcdưới da cho 3 lợn, mỗi con tiêm 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.
2) Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng(phương pháp thay thế): Tiêm bắp hoặc dưới da cho 5 chuột nhắt trắng, mỗi con0,5 ml vắc-xin.
Các liều tiêm trong hai phương pháp trên đềuđược theo dõi sau thời gian 14 ngày.Lô vắc-xin được coi là đạt nếu tất cả lợntiêm an toàn sống khỏe mạnh, không có phản ứng cục bộ cũng như toàn thân.
Kiểmtra hiệu lực: Lựachọn một trong hai phương pháp:
1) Hiệu lực trên lợn: Tiêm bắp hoặc dưới da05 lợn, mỗi con tiêm 1 liều vắc-xin ghi trên nhãn. Tiêm nhắc lại sau 14 ngày vớiliều như lần 1.
Sau khi tiêm nhắc lại 14 ngày, lấy máu lợn miễndịch và đối chứng, thu huyết thanh làm phản ứng ELISA xác định hàm lượng khángthể bằng phản ứng huyết thanh học.
Lô vắc-xin được coi là đạt hiệu lực nếu hiệugiá kháng thể kháng độc tố đường ruột tái tổ hợp STa-LTB-STb trong huyết thanhcủa lợn miễn dịch ≥ 6 log2, lợn đối chứng âm tính.
2) Hiệu lực trên chuột nhắt trắng (phươngpháp thay thế): Tiêm vào dưới da hoặc bắp thịt cho 10 chuột nhắt trắng, mỗi con0,1 ml vắc-xin, 10 chuột đối chứng không tiêm vắc-xin. Sau 14 ngày tiêm lần 1,tiến hành tiêm nhắc lại cho chuột miễn dịch với liều 0,1 ml vắc-xin. Sau khitiêm nhắc lại 14 ngày, lấy máu chuột miễn dịch và chuột đối chứng, thu huyếtthanh làm phản ứng huyết thanh học.
Lô vắc-xin được coi là đạt hiệu lực nếu hiệugiá kháng thể kháng độc tố đường ruột tái tổ hợp STa-LTB-STb trong huyết thanhcủa chuột miễn dịch ≥ 6 log2, chuột đối chứng âm tính.
4. Kết luận và đề nghị
-Đã tạo được 2 chủng vi khuẩn E. colimang vector biểu hiện protein độc tố đường ruột tái tổ hợp STa – LTB – STb(protein SLS). Protein tái tổ hợp này biểu hiện tốt trên chủng vi khuẩn chọn lọc(chủng SLS321 và SLS243).
-Đã xây dựng được quy trình sản xuất, kiểm nghiệm, bảo quản và sử dụng vắc-xin độctố đường ruột tái tổ hợp STa – LTB – STb (vắc-xin Coli RE I.Vac).
-Đã sản xuất thành công vắc-xin độc tố đường ruột tái tổ hợp Coli RE I.Vac. Vắc-xinđạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn (100%), hiệu lực (100%) trên chuột nhắt trắngvà lợn. Vắc-xin đã được Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI đánh giá đạt yêucầu theo quy định
- Đề nghị chuyển tiếp dự án sảnxuất thực nghiệm để hoàn thiện sản phẩm.