CNSH Nông nghiệp
Một số giải pháp để tối ưu và tăng tốc phản ứng PCR
(vjst.vn - 24/02/2020):

Kỹ thuật PCRđược tiến hành hàng ngày trong hầu hết các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.PCR hiện là phương pháp nhanh nhất và an toàn nhất để khuếch đại ADN, tuy nhiênphương pháp này chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như ADN mẫu làm khuôn, chấtlượng của enzyme ADN polymerase, chất lượng của mồi, và đặc biệt là thiết bị vàdụng cụ. Do đó, nhu cầu tăng tốc và tối ưu hóa các phản ứng PCR là rất lớn vànó có thể được tiếp cận theo nhiều cách khác nhau. Bài viết này giới thiệu mộtsố giải pháp giúp tối ưu và tăng tốc phản ứng PCR.

Một vài nét về kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật chophép khuếch đại một đoạn gen trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Dựa vàocác thành phần phản ứng cần thiết, đoạn gen mục tiêu sẽ được nhân bản ra hàngtriệu bản sao giống nhau, từ đó phục vụ những mục đích nghiên cứu tiếp theo.Đây được xem là một quá trình cơ bản cho việc phát triển của hàng loạt côngnghệ phân tích gen và hệ gen sau này. 

Kỹ thuật PCR được nhà hóa sinh học người Hoa Kỳ Kary Mullis (1944-2019) pháttriển vào năm 1985 dựa trên ý tưởng muốn xây dựng một quy trình giúp đoạn ADNcó thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ phản ứng thông quaxúc tác của enzyme ADN polymerase. Ý tưởng này được ấp ủ khi ông muốn khuyếchđại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sốngnhư vi khuẩn E. coli hay nấm men để tách sợi đôi ADN thành haimạch đơn, sau đó sử dụng các cặp mồi bổ sung để bắt cặp với mạch đơn, tái bảnnhờ enzyme ADN polymerase. Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích genlà ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp,khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ramột số lượng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn. Kết quả này đã manglại cho Kary Mullis Giải thưởng Nobel về hóa học năm 1993. 

Thành công của Kary Mullis trong việc phát triển kỹ thuật PCR có sự đóng góprất lớn của một loạt nghiên cứu từ những năm 50 của thế kỷ trước. Cụ thể,Arthur Komberg, một nhà hóa sinh người Hoa Kỳ đã bắt đầu nghiên cứu cơ chế saochép ADN và phát hiện ra enzyme ADN polymerase vào khoảng những năm 50. Đến năm1953, James D. Watson (Hoa Kỳ) và Francis Crikc (Anh) đã tìm ra cấu trúc mạchđôi của phân tử ADN. Họ cho rằng với cấu trúc như vậy, thông tin di truyền cóthể được sao chép và nhân lên. Đến những năm 60, một phương pháp tương tự chophép nhân đôi mạch ADN nhờ cặp mồi và ADN polymerase đã được xây dựng bởi KjellKleppe (Na Uy) và Har Gobind Khorana (Hoa Kỳ). Tuy nhiên, Kary Mullis với kỹthuật PCR đã tỏ ra ưu thế hơn hẳn nhờ sử dụng chu kỳ nhiệt, cho phép nhân bảnsợi ADN một cách nhanh chóng với số lượng lớn. 

Một điểm thú vị là enzyme ADNpolymerase phân lập từ E. coli không bền nhiệt, cần được bổsung sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ nhiệt, vì vậy quy trình này rấtchậm, tốn kém và mất nhiều công sức. Vấn đề này đã được giải quyết khi nhà visinh vật học Thomas Brock (Hoa Kỳ) tình cờ phát hiện ra vi khuẩn chịunhiệt Thermophilus aquaticus (hay Taq) ở khu vực suối nướcnóng (>70oC) tại Công viên quốc gia Yellowstone, Hoa Kỳ vào đầunhững năm 60. Việc phát hiện ra enzyme Taq polymerase đã giúp PCR trở thành mộtcuộc cách mạng trong di truyền học phân tử, là một trong những kỹ thuật cơ bảnđược ứng dụng ở tất cả các phòng thí nghiệm trên thế giới hiệnnay.      

Ứng dụng của kỹthuật PCR

Hiện nay, kỹ thuật PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ y học,cổ sinh vật học đến pháp y... Một trong những ứng dụng phổ biến nhất của PCR làtrong lĩnh vực khoa học pháp y. Trước khi ra đời kỹ thuật PCR, một mẫu ADN nhỏcó thể không đủ để thực hiện xét nghiệm chính xác và đưa ra kết luận chắc chắn.Tuy nhiên, bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR, các nhà nghiên cứu có thể tạo đủlượng ADN để xác định hài cốt từ các vụ tai nạn hay thảm họa trong quá khứ...Tương tự, các mẫu ADN nhỏ được phục hồi từ hiện trường vụ án có thể được saochép bằng PCR và sau đó được kiểm tra để xác định hoặc giúp loại trừ các nghiphạm.

Trong y học hiện đại, PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vựcnghiên cứu ung thư. PCR được sử dụng để phát hiện một số bệnh ung thư do virusgây ra như ung thư cổ tử cung (gây ra bởi virus u nhú ở người -HPV), ung thưda, ung thư miệng. Một ứng dụng y tế quan trọng khác của PCR là trong quy trìnhphân loại mô để xem xét khả năng tương hợp giữa mô người hiến tạng và nhữngbệnh nhân cần trải qua cấy ghép nội tạng; lựa chọn phương pháp điều trị thíchhợp cho bệnh nhân, xét nghiệm quan hệ di truyền; xác định sớm các bệnh truyền nhiễmcũng như theo dõi sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ở người hoặc động vật.Ngoài ra, PCR có thể xác định cả nhiễm nấm và ký sinh trùng (có thể phát hiệnnhiễm HIV ngay cả trước khi bất kỳ kháng thể nào được tạo ra). Khuếch đại ADNcũng được sử dụng thường xuyên để sàng lọc máu được hiến để ngăn máu nhiễm bệnhxâm nhập vào ngân hàng máu.

Trong lĩnh vực cổ sinh vật học, PCR được sử dụng để khếch đại những mẫu vật ADNtồn tại trong các mô trên một trăm ngàn năm tuổi. Kỹ thuật này có thể được sửdụng trên các mẫu mô xác ướp, hệ thực vật và động vật cổ đại, hoặc các hóathạch. Do đó, việc sử dụng PCR trong lĩnh vực này giúp chúng ta xác định và tìmhiểu về các sinh vật hiện đã tuyệt chủng cùng các quá trình hóa thạch và tiếnhóa. 

Kỹ thuật PCR còn tỏ ra hữu ích trong một số khía cạnh của vi sinh vật môitrường. Chúng được sử dụng để giúp phát hiện, xác định vi khuẩn và mầm bệnh cóhại trong nguồn nước công cộng; phát hiện các vi sinh vật thoái hóa, nơi chấtthải độc hại và sự cố ô nhiễm đã xảy ra. 

Tại Việt Nam, PCR và các kỹ thuật dựa trên nền tảng PCR đang được ứng dụng phổbiến trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như y học (phát hiện bệnh ditruyền, nhận dạng vân tay ADN và xác định huyết thống), nông nghiệp (chọn dòngcá thể lai nhờ chỉ thị phân tử, xác định bệnh và kiểm định giống)...

Nguyên tắc và một số giải pháp nângcao chất lượng của kỹ thuật PCR  
Nguyên tắc của phươngpháp PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạtđộng của enzyme Taq polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bảnđể thực hiện phản ứng PCR (tổng thể tích dao động khoảng 20-50 µl) bao gồm: i)Sợi khuôn ADN (chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cầnnhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide); ii) Hai đoạn mồi ngắn để xác địnhcác điểm bắt đầu tổng hợp ADN (mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ởhai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung); iii) Có đầyđủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP; iv) Môi trường đệm cung cấp ionMg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và ADNse; v) Enzyme chịu nhiệt Taq.

Trong phản ứng PCR, chúng ta thường dựa vào các bộ kit hoá chất thương mại cókhả năng mang lại năng suất tối ưu cùng với quy trình nhanh hơn. Tuy nhiên,việc chuẩn bị mẫu, cũng như các thiết bị và vật tư tiêu hao trong quy trình làmPCR sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng theo những cách không được đánh giáthường xuyên. Vì vậy, một số giải pháp đã được đưa ra nhằm cải thiện và tăngtốc độ của phản ứng PCR. 

            Thứnhất, cải thiện vật liệu block nhiệt phù hợp làm tăng tốc độ gia nhiệtvà hạ nhiệt. Các vật liệu dẫn nhiệt được sử dụng làm hợp kim cho block nhiệtbên trong thiết bị PCR có tác dụng tăng và hạ nhiệt. Nhôm là vật liệu tiêuchuẩn thường được sử dụng, tuy nhiên block nhiệt cấu tạo từ hợp kim bạc sẽ đạtđược tốc độ gia nhiệt nhanh gấp đôi. Tốc độ gia nhiệt và hạ nhiệt nhanh giúpphản ứng PCR diễn ra nhanh hơn. Điều quan trọng là nhiệt độ phải đạt được mộtcách đáng tin cậy, với độ lệch tối thiểu, độ vượt giá trị được kiểm soát và đểđảm bảo điều này, chúng ta cần kiểm tra định kỳ, lý tưởng là sử dụng bộ thiếtbị về kiểm tra nhiệt độ Temperature Verification System (TVS).

            Thứhai, công nghệ gradient nhiệt 2 chiều mới giúp tối ưu hoá phản ứngPCR. Công nghệ gradient nhiệt giúp tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhanh chóng. Tínhnăng này là một cuộc cách mạng trong quá trình tối ưu hoá phản ứng PCR. Tuynhiên để xác định nhiệt độ biến tính tối ưu, chúng ta phải chạy thêm một hoặcnhiều phản ứng PCR nữa. Một lần nữa, công nghệ 2D-gradient được phát triển.Theo cách này, nhiệt độ biến tính khác nhau có thể được chọn trong mỗi hàng,trong khi đồng thời nhiệt độ gắn mồi khác nhau được chọn trong mỗi cột. Nhiệtđộ tối ưu sẽ ngăn chặn sự biến tính và gắn mồi không hoàn chỉnh. Tính năng nàycho phép xác định nhiệt độ tối ưu và dẫn đến năng suất tối đa cũng như kết quảPCR lặp lại tối ưu.

            Thứba, tối ưu hóa vật tư tiêu hao để tăng tốc phản ứng PCR. Một cách khácđể tăng tốc độ chạy phản ứng PCR là việc sử dụng bộ kit hoá chất PCR được pháttriển đặc biệt kết hợp với ống PCR nhanh. Ống PCR nhanh có thành ống mỏng, đồngthời duy trì sự ổn định của chúng - một tính năng cho phép gia nhiệt và hạnhiệt mẫu nhanh hơn. Nhiệt độ bên trong mẫu đạt đồng đều hơn và với sự trợ giúpcủa bộ kit PCR nhanh, một lần chạy PCR được hoàn thành trong vòng 16 phút. Thêmvào đó, việc sử dụng ống PCR nhanh mang lại năng suất ADN tăng hơn nhiều lần.

            Thứtư, số lượng mẫu nhiều, kiểm soát tập trung sẽ làm giảm thời gian chocác quy trình chạy phản ứng PCR. Nếu có nhiều hơn một máy PCR để chạy chươngtrình trong phòng thí nghiệm, và được kiểm soát tập trung sẽ làm giảm thời gianthao tác với máy. Với máy PCR của Hãng Eppendorf (Đức), 50 máy PCR khác nhau sẽđược kết nối vào trong một mạng (network) và được điều khiển bằng phần mềmtrung tâm, theo cách này có thể dùng 30 máy chạy chương trình thứ nhất và 20máy chạy chương trình thứ hai. Đối với các phòng thí nghiệm số lượng mẫu thấphơn, 9 máy PCR có thể kết nối mạng lan với nhau và được điều khiển trên mộtbảng điều khiển của một máy chính. Điều này giúp tiết kiệm thời gian trong quátrình cài đặt chương trình.

Ngoài ra, có thể tối ưu hóa các kết quả PCR thông qua các điều chỉnh thiết kếmồi, thành phần của hỗn hợp PCR master mix hoặc quy trình chuẩn bị mẫu. Thêmvào đó, sự kết nối của nhiệt độ biến tính và nhiệt độ gắn mồi cũng như thờigian kéo dài chuỗi có thể rất quan trọng đối với lượng ADN cụ thể, độ tinhkhiết và chất lượng của nó. Rất đáng để thử nghiệm tất cả các tùy chọn trướckhi mua một bộ mới hoặc đặt hàng mồi mới. 

Thay lời kết

Kể từ khi phát triển vào đầu những năm 80, kỹ thuật PCR đã mở ra nhiều khả năngvà giúp chúng ta hiểu rõ hơn về thế giới hiện tại và trong quá khứ. Tương lai,các kỹ thuật PCR trong cổ sinh vật học phân tử thậm chí có thể được sử dụngtrong thám hiểm không gian để giúp xác định liệu sự sống đã từng tồn tại trêncác hành tinh khác trong hệ mặt trời của chúng ta hay xa hơn nữa. Có nhiều cáchđể cải thiện và nâng cao chất lượng cũng như rút ngắn thời gian chạy phản ứngPCR - bắt đầu bằng việc lựa chọn thiết bị và dụng cụ, vật tư hoá chất tiêu haophù hợp cho đến ứng dụng các công nghệ mới... Việc phát hiện ra sự kết hợp tốiưu có thể mất một ít thời gian, và nỗ lực ban đầu sẽ được đền đáp xứng đángdưới dạng tiết kiệm chi phí và thời gian. 

 

 
Tin tức khác
Xác định loại enzyme tạo điều kiện cho việc ghép giữa các cây thuộc họ khác nhau
Chỉnh sửa gene gia súc
Gen điều khiển anthocyanine của cây ớt (Capsicum annuum L.)
Giống cây trồng chuyển nạp gen Bt không ảnh hưởng đến động vật không xương sống trong đất
Di truyền tính chống chịu khô hạn của khoai lang
Thông báo
Thông báo chuẩn bị hồ sơ đăng ký giao trực tiếp thực hiện từ năm 2019 thuộc Chương trình CNSH
Thông báo số 1: Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc – Khu vực phía Nam lần thứ II năm 2011
Quyết định 490/QĐ-BNN-KHCN điều chỉnh cá nhân chủ trì đề tài thuộc “chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và ptnt đến năm 2020”.
THÔNG BÁO TUYỂN CHỌN TỔ CHỨC VÀ CÁ NHÂN CHỦ TRÌ NHIỆM VỤ KH&CN
Kết quả khảo nghiệm đánh giá an toàn sinh học đối với đa dạng sinh học và môi trường
Văn bản mới
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thông báo giao trực tiếp tổ chức, cá nhân thực hiện nhiệm vụ KHCN...
Quyết định 490/QĐ-BNN-KHCN điều chỉnh cá nhân chủ trì đề tài thuộc “chương trình trọng điểm phát triển...
Quyết định phê duyệt danh mục nhiệm vụ khoa học và công nghệ đưa vào tuyển chọn, giao trực tiếp bắt đầu...
Về việc cấp bằng bảo hộ giống cây trồng mới (kèm danh mục)
Bổ sung 71 chỉ tiêu tuyển sinh đào tạo thạc sĩ năm 2011 cho Trường Đại học Lâm nghiệp
Về việc giao dự toán NSNN năm 2011(Kinh phí bổ sung sự nghiệp khoa học Công nghệ năm 2011- nhiệm vụ cấp...
Giao dự toán ngân sách nhà nước năm 2011 (đợt 4) Kinh phí xử lý sự cố đê điều năm 2011 (Phụ lục kèm theo)
Tài Liệu mới
Rút ngằn thời gian vi nhân giống lan hồ điệp
Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
Ảnh hưởng của các yếu tố sinh học lên sự nảy mầm
Kỹ thuật trồng hoa lan Mokara
Liên kết Website
Vụ khoa học công nghệ và môi trường bộ NN và PTNT
Viện công nghệ sinh học
Bộ nông nghiệp vf phát triển nông thôn
Agbiotech Việt Nam
Báo Nhân Dân
Trung tâm Khuyến nông Quốc gia
Thống kê truy cập
Số người đang online: 28
Tổng số lượt truy cập: 1961029
Ngân hàng Nông nghiệp và phát triển nông thôn
Copyright © 2011 Văn phòng Công nghệ sinh học - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
Địa chỉ : Số 02 Ngọc Hà, Ba Đình, Hà Nội. Điện thoại : (024) 38436817 - Fax: (024) 38433637
Email: webmaster@agrobitotech.gov.vn. Web site: www.agrobiotech.gov.vn